氧化锌(zinc oxide, ZnO)具有广泛的抗菌性能，具有价格低廉、 绿色安全、 资源丰富、 稳定性强等特点，常被用于食品添加剂、化妆品、 抗菌剂等众多领域[1-2]。由于ZnO表面的羟基容易在光的影响下与电子跃迁产生的电子空穴对反应，形成羟基自由基、超氧离子和过氧羟基自由基，易使细胞产生氧化反应应激导致细胞退化，削弱了生物抗菌领域的应用。
为了提高ZnO的抗菌性能，提高生物兼容性是必不可少的。壳聚糖(chitosan, CS)作为自然界中含量丰富的天然多聚物，不仅具有生物可降解性、 生物相容性、 无毒性和重金属离子吸附能力[3]， 而且对人体也有良好的抑菌、 抗癌、 降脂、 增强免疫能力等多种功能，同时外观形貌可塑性强，应用方便。CS通过简易的物理、 化学等方法加工后即可制成粉末、 微珠、 纤维和薄膜[4]。
利用CS搭载ZnO进行协同抗菌， 有利于提升材料在抗菌领域的应用价值。 例如， 徐赵萌等[5]将壳聚糖作为外层膜包裹Ag+、 Zn2+等金属离子， 使金属离子发挥更好的抗菌效用， 并且膜表面疏水性也得到了改善。 方丹丹等[6]将丁香油和纳米氧化锌加入到壳聚糖中制备壳聚糖基纳米氧化锌， 提高了材料的抗菌性， 可应用于鲜肉保鲜。 张晨宇等[7]将ZnO颗粒和乳酸链球菌素掺入到海藻酸钠中， 再覆盖至纤维素纸表面， 赋予其抗菌活性， 可用于奶酪包装。 可见， ZnO的抗菌性能已广泛运用在各领域， 但是， 采用液相沉淀法制备氧化锌-壳聚糖(zinc oxide-chitosan, ZnO-CS)复合材料， 有关其结构和抗菌效果的内在联系的研究还尚未见报道。
综上，本文中以硝酸锌(zinc nitrate，Zn(NO3)2)为锌源，以CS为基底，以氢氧化钠(sodium hydroxide, NaOH)为沉淀剂， 采用液相沉淀法制备具有抗菌性能的ZnO-CS复合材料； 将ZnO-CS涂抹在新鲜熟白米上研究ZnO-CS的抗菌性能； 通过扫描电镜、 X射线衍射分析、 热重分析、 X射线光电子能谱、 傅里叶交换红外光谱、 紫外可见近红外分光光度计等技术探讨ZnO-CS复合材料的形貌、 结构组成以及ZnO在CS表面的吸附情况， 旨在为新型抗菌材料的开发提供理论依据和技术支持。
1 实验
1.1 试剂材料
以Zn(NO3)2为锌源，以CS为基底，以NaOH作为沉淀剂，在一定温度条件下，使溶液中的Zn2+、 OH-和O2-反应生成ZnO，采用液相沉淀法工艺制备新型抗菌复合材料ZnO-CS，所用试剂材料见表1。
表1 试剂材料
Tab.1 Reagent materials
名称化学式厂家壳聚糖(脱乙酰度≥95%)(C6HNO4)n上海麦克林生化科技有限公司硝酸锌Zn(NO3)2·H2O天津市致远化学试剂有限公司氢氧化钠NaOH无锡市亚泰联合化工有限公司
1.2 氧化锌-壳聚糖复合材料的制备
图1为氧化锌-壳聚糖复合材料的制备过程示意图。 由图可以看出， 首先将浓度为0.3 mol/L的Zn(NO3)2溶液和10 g CS进行混合得到初始悬浊液， 随后以浓度为0.5 mol/L的NaOH溶液作为沉淀剂， 将初始悬浊液的pH调至中性(pH为7)， 将悬浊液置于集热式磁力搅拌器中， 通过调节搅拌器使悬浊液在温度为80 ℃的恒温水浴锅内搅拌2 h， 再通过NaOH沉淀剂调节悬浊液pH至8～9后继续搅拌1 h， 将悬浊液通过离心机获取沉淀物后置于温度为125 ℃的烘箱中烘干15 min， 最后得到的白色粉末为ZnO-CS复合材料。
图1 氧化锌-壳聚糖复合材料的制备过程示意图
Fig.2 Schematic diagram of preparation process of zinc oxide-chitosan composite materials
图2为氧化锌-壳聚糖复合材料的制备过程中悬浊液的状态变化。由图2(a)可见，初始悬浊液呈混浊状态，表明液体中Zn2+附着在CS表面上形成一层Zn2+-CS复合物。由图2(b)可见，将悬浊液调制pH为7时生成大量白色沉淀物，悬浊液由混浊状态逐渐透明化，表明液体中的Zn2+已经逐渐生成Zn(OH)2前驱物[8]。由图2(c)可见，悬浊液在80 ℃恒温水浴锅中搅拌2 h后，液体中白色沉淀增多，上层更加透明，表明液体中的Zn2+已大量生成Zn(OH)2前驱物，而且由于受热反应，少量的Zn(OH)2发生分解后生成ZnO沉淀物。由图2(d)可见，通过沉淀剂NaOH调pH和恒温加热搅拌后，悬浊液上层呈现完全透明状态，表明液体中已完全生成Zn(OH)2，且Zn(OH)2经过3 h的受热反应，生成少量的ZnO白色沉淀。由图2(e)可见，经过125 ℃烘箱烘干水分后，复合材料中的Zn(OH)2受热完全生成ZnO，得到最后白色粉末状的ZnO-CS复合材料。
(a)初始悬浊液(b)开始搅拌(c)搅拌2 h(d)搅拌3 h(e)烘干后的ZnO-CS图2 氧化锌-壳聚糖复合材料的制备过程中悬浊液的状态变化Fig.2 State changes of suspension during preparation of zinc oxide-chitosan composite materials
1.3 测试仪器与设备
实验所用测试仪器与设备见表2。
表2 测试仪器与设备
Tab.2 Test instruments and equipment
仪器名称规格型号用途生产厂家扫描电子显微镜日立HITACHI SU8010形态、形貌分析日本日立公司X射线衍射仪布鲁克D8 advance确定材料中存在的物相日本岛津公司热重分析仪STA8000测定复合材料的热稳定性梅特勒托利多科技(中国)有限公司紫外可见近红外分光光度计TP720测量物质对可见光或紫外光的吸光度长富科技(北京)有限公司X射线光电子能谱(XPS)Thermo Kalpha分析表面元素的及其种类和价态美国Kratos公司傅立叶变换红外吸收光谱仪(FTIR)Thermo Nicolet IS5解析复合材料官能团的信息美国OCEAN公司集热式磁力搅拌器DF-101S用于搅拌或加热搅拌同时进行深圳市鼎鑫宜实验设备有限公司
1.4 氧化锌-壳聚糖复合材料的抗菌实验
首先称取质量为1 g已制备的ZnO-CS复合材料， 将其混合于5 mL的去离子水中， 制成ZnO-CS悬浊液； 取5 g当天煮熟未经冷藏、 除水等保鲜处理的熟白米，将ZnO-CS悬浊液均匀涂抹在熟白米表面，随后装入用酒精和紫外线消毒过的玻璃溶剂瓶中；称取未涂抹ZnO-CS悬浊液的新鲜熟白米5 g作为对照组；于室温下自然发酵，每2 d拍照记录1次新鲜熟白米中的菌落变化情况。
2 结果及讨论
2.1 氧化锌-壳聚糖复合材料的形貌分析
图3为不同沉积时间时氧化锌-壳聚糖复合材料的SEM图像。 由图3(a)可见， 搅拌3 h后CS为不规则块状形态。 当样品在温度为80 ℃的恒温水浴时， 悬浊液饱和度较低， 悬浊液中Zn(OH)2沉淀在CS表面， 当Zn(OH)2沉淀物受热时发生脱水反应生成ZnO。因为样品中Zn(OH)2沉淀物未完全受热反应生成ZnO，所生成的部分ZnO粒子周围仍存在Zn(OH)2和游离的Zn2+，样品中存在的ZnO粒子达到或超过晶核临界尺寸时，在液体环境中就会以其为晶核长成的条形ZnO[9-10]。图3(b)为在温度为125 ℃的烘箱烘干后所得的固体沉淀物ZnO-CS复合材料，CS表面被ZnO覆盖，这是由于在加热烘干时，溶液中大量的Zn(OH)2受热分解为ZnO，由于CS中的有机大分子与Zn(OH)2中的羟基组成交联网络的作用，使生成ZnO的形貌呈现粒径约为500 nm的片状型颗粒[11]。
(a)搅拌3 h(b)烘干后图3 不同沉积时间时氧化锌-壳聚糖复合材料的SEM图像Fig.3 SEM images of zinc oxide-chitosan composite materials at different deposition times
图4为烘干后氧化锌-壳聚糖复合材料的SEM-EDS元素分布图。由图可见，Zn、 O元素在复合材料中的分布基本重合，而且Zn、 O元素的质量分数明显多于N、 C的，进一步佐证了ZnO有效负载在CS表面。
(a)氧化锌-壳聚糖秒扫选区图(b)元素分布图(c)O元素(d)N元素(e)C元素(f)Zn元素图4 烘干后氧化锌-壳聚糖复合材料的SEM-EDS元素分布图Fig.4 SEM-EDS element distribution of zinc oxide-chitosan composite materials after drying
2.2 氧化锌-壳聚糖复合材料的结构分析
图5为不同沉积时间时氧化锌-壳聚糖复合材料的XRD图谱。由图可见，黑色衍射峰为Zn(NO3)2与CS悬浊液经搅拌沉积3 h后所生成的Zn2+-CS衍射峰，红色衍射峰为烘干后的ZnO-CS衍射峰；Zn2+-CS图谱在2θ为21.2 °、 44.7 °时的衍射峰分别对应Zn晶体的(006)、 (101)晶面； ZnO-CS图谱在2θ为34.4 °、 47.5 °、 56.6 °时的衍射峰， 分别对应ZnO晶体的(002)、 (102)、 (110)晶面， 表明通过调节pH和充分受热反应后， 溶液中的Zn2+、 OH-、 O2-已反应生成ZnO[12-14]； 另外， 在2θ为12 °～36 °时存在1个宽峰， 这是复合物中CS的衍射峰， Zn2+-CS到ZnO-CS的CS峰形的改变是由于在实验过程中加入的NaOH溶液， 使CS分子中的—NH—CO—、 —NH2、 —OH等活性基团与溶液中的Zn2+、 Zn(OH)2和OH-发生配位的同时也产生了相分离， 改变了CS的晶体结构， 从而使CS复合物的峰形发生改变[15]； 在CS衍射峰上存在多个尖锐的衍射峰， 这是由于产物中含有未分解的Zn(OH)2， 因为Zn(OH)2无定型， 在衍射峰标准卡片中无法确定具体的Zn(OH)2晶面。
图5 不同沉积时间时氧化锌-壳聚糖复合材料的XRD图谱
Fig.5 XRD spectra of zinc oxide-chitosan composite materials at different deposition times
图6为不同沉积时间时氧化锌-壳聚糖复合材料的TG图谱。 由图可以看出， ZnO-CS的热失质量分为3个阶段， 当在Ⅰ区域温度为0～100 ℃时， 由样品中表面吸附水和孔隙吸附水蒸发所致， 热失质量分数约为1.87%； 当在Ⅱ区域温度为100～231.6 ℃时， Zn(OH)2开始受热分解， 热失质量分数约为2.50%； 当在Ⅲ区域温度为231.6～800 ℃时， ZnO-CS中CS大量分解， 热失质量分数高达58.43%。 在温度低于318.2 ℃时， ZnO-CS的失质量分数小于Zn2+-CS的原因在于ZnO-CS经干燥处理后所含水分已被大量蒸发，Zn(OH)2更少一些； 在温度高于318.2 ℃时， ZnO-CS样品失质量分数大于Zn2+-CS样品的原因在于Zn2+-CS样品中新生成的ZnO均匀包裹CS， 减少了CS中有机杂质的氧化和分解[16-17]。
图6 不同沉积时间时氧化锌-壳聚糖复合材料的TG图谱
Fig.6 TG spectra of zinc oxide-chitosan composite materials at different deposition times
图7为不同沉积时间时氧化锌-壳聚糖复合材料的XPS图谱。由图7(a)所示，结合能为1 045.1、 1 022.1 eV的2个峰分别是由Zn2+的Zn 2p3/2和Zn 2p1/2跃迁引起的，说明当CS与Zn(NO3)2溶液混合时，悬浊液中Zn2+已被吸附到CS氨基中[17]。由图7(b)、 (c)可见，烘干后的ZnO-CS中Zn 2p和O 1s元素含量明显减少，在结合能为1 045.1、 533.63 eV处的强峰对应于ZnO中与Zn原子复位的Zn、 O原子，表明溶液中已生成ZnO化合物。
(a)全部元素(b)Zn 2p(c)O 1s图7 不同沉积时间时氧化锌-壳聚糖复合材料的XPS图谱Fig.7 XPS spectra of zinc oxide-chitosan composite materials at different deposition times
图8为不同沉积时间时氧化锌-壳聚糖复合材料的FTIR图谱。 由图可以看出， ZnO-CS的吸收峰明显强于Zn2+-CS的； 因为加入了NaOH沉淀剂，CS的有机大分子与Zn(OH)2和NaOH发生反应， 引起了—OH在波数为3 440、 1 640 cm-1处的伸缩振动； CS上的原子和Zn2+发生配位引起的—NH重叠峰在波数为3 448、 1 540 cm-1处向低波数偏移； CS分子中的—CN与ZnO间发生了静电作用导致波数在1 380 cm-1处伸缩振动[18-19]； Zn2+与—OH配位引起—C3OH和—C6OH在波数为1 150、 1 099 cm-1处向高波数移动； CS上C—C—O特征吸收峰在波数为1 028 cm-1处拉伸振动， 表明CS分子与纳米ZnO之间有较强的氢键作用； CS分子中的—CH2—在波数为940 cm-1处特征吸收锋位置发生变化。
图8 不同沉积时间时氧化锌-壳聚糖复合材料的FTIR图谱
Fig.8 FTIR spectra of zinc oxide-chitosan composite materials at different deposition times
由于CS是含O的环状聚合物以及ZnO晶体具有良好的紫外光致发光性能，因此可以通过紫外可见近红外分光光度计测试ZnO-CS复合材料的紫外吸收强度，检测出ZnO在CS表面的覆盖率[20]。图9为烘干后氧化锌-壳聚糖复合材料的紫外吸收谱图。由图可见，在近紫外区中波长为270、 410 nm处有明显的吸收峰，表明CS对金属离子的吸收出现明显变化，进一步证实了ZnO晶体已覆盖在CS表面。
图9 烘干后氧化锌-壳聚糖复合材料的紫外吸收谱图
Fig.9 Ultraviolet absorption spectrum of zinc oxide-chitosan composite materials after drying
2.3 氧化锌-壳聚糖复合材料形成机理
图10为不同沉积时间时氧化锌-壳聚糖复合材料的反应机理图。 由图可以看出， 反应分为5个步骤： 1)Zn2+吸附到CS表面的氨基上； 2)加入NaOH沉淀剂， 溶液中Zn2+与OH-反应生成Zn(OH)2沉淀； 3)Zn(OH)2受热分解为ZnO， 少量的ZnO溶于碱生成锌酸盐(ZnO卆的盐类)， 同时溶液中CS表面的氨基缓慢质子化形成
通过静电间的相互作用与溶液中的Zn2+、 ZnO和ZnO卆的盐类交联， 形成交联网络； 4)经加热干燥后在CS表面的Zn2+、 Zn(OH)2受热后完全氧化， 通过CS中的有机大分子网格形成粒径约为500 nm的片状ZnO颗粒； 5)再由CS表面的氨基所形成的交联网络吸附ZnO，得到ZnO-CS复合材料。
图10 不同沉积时间时氧化锌-壳聚糖复合材料的反应机理图
Fig.10 Reaction mechanism diagram of zinc oxide-chitosan composite materials at different deposition time
2.4 抗菌性能
称取质量为1 g的ZnO-CS复合材料， 将其混合于5 mL的去离子水中制成ZnO-CS悬浊液， 并均匀涂抹在质量为5 g的新鲜熟大米的表面， 制成测试样本； 另取质量为5 g新鲜熟大米作为对照组。 图11为氧化锌-壳聚糖复合材料的抗菌性测试。 由图可以看出， 在时间为2 d时测试样本和对照组尚无明显区别， 在时间为4 d时熟白米已产生大量浅黄色的黄曲霉毒素和黄绿色的黄绿青霉素， 在时间为6 d时熟白米已生长大量的灰白色菌丝， 在时间为8、 10 d时熟大米表面霉菌菌落急剧增多， 在时间为12 d时熟白米已完全被菌落包覆； 在时间为6 d之前， 测试样本均未发现霉菌生成， 在时间为8 d时开始出现微小霉菌菌落， 在时间为12 d时测试样本只在2处发现微小的菌落存在， 表明ZnO-CS有很强的抗菌活性， 其抗菌机理有待进一步研究。
(a)2 d(b)4 d(c)6 d(d)8 d(e)10 d(f)12 d图11 氧化锌-壳聚糖复合材料的抗菌性测试Fig.11 Test for antibacterial activity of zinc oxide-chitosan composite materials
3 结论
以Zn(NO3)2为锌源，以CS为基底， 以NaOH为沉淀剂， 采用液相沉积法制备具有抗菌性能的ZnO-CS复合材料； 采用SEM、 SEM-EDS、 XRD、 TG-DTA、 XPS、 FTIR和UV-Vis探讨ZnO-CS的形貌、 结构组成以及ZnO在CS表面的吸附情况； 将ZnO-CS悬浊液涂抹在新鲜熟白米上， 进行ZnO-CS复合材料的抗菌性能测试。
1)Zn2+-CS表面首先生长了一层棒状ZnO粒子膜，然后通过受热反应CS表面的氨基与Zn2+、 ZnO形成交联网络，使棒状ZnO进一步生长形成片状ZnO；再由CS表面的氨基所形成的交联网络吸附ZnO，得到ZnO-CS复合材料。
2)在6 d的时间内，用ZnO-CS悬浊液处理后的新鲜熟白米没有生成菌落，在时间为8 d时有微小菌落生成，在时间为10、 12 d时菌落无明显扩散，表明ZnO-CS具有良好的抗菌作用。
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